هورمون رشد و تولید شیر


Widget not in any sidebars

بسط
72
50 ثانیه
بسط نهایی
72
5 دقیقه
1
برای بررسی نتیجه واکنشهای PCR، ژل آگارز یک درصد به شیوهی بیان شده در بخش 3-1-1 تهیه شد. سپس، 4 میکرولیتر از فرآوردههای PCR با یک میکرولیتر بافر بارگذاری آمیخته شد، و به چاهک ژل انتقال یافت. ولتاژ دستگاه در 80 ولت تنظیم و برای 90 دقیقه فرآیند الکتروفورز انجام شد. پس از پایان الکتروفورز، ژل روی صفحهی U.V. Transilluminator بررسی و از آن عکسبرداری شد. به کمک خطکشهای DNA که همراه نمونهها در ژل بارگذاری شده بود، قطعات تکثیر شده، اندازهگیری شدند. خطکشهای DNA، قطعاتی از مولکول DNA با وزن مولکولی مشخص و استاندارد هستند که برای تعیین اندازهی قطعات DNA استفاده میشوند.
3-5- هضم محصولات PCR با آنزیمهای برشی
پس از انجام واکنشهای زنجیرهای پلیمراز و بررسی درستی قطعههای مورد نظر (bp 428 برای ژن هورمون رشد و bp 342 برای ژن گیرنده هورمون رشد) با ژل آگارز یک درصد، واکنشهای هضم آنزیمی با آنزیم محدودکنندهی AluI برای هر دو ژن انجام شد. واکنشهای هضم در حجم 15 میکرولیتر و به صورت زیر انجام شد. آنزیم محدودکننده AluI توالی AGCT را شناسایی میکند و اتصال بین باز گوانین و سیتوزین را برش میزند. این آنزیم توسط باکتری گرم مثبت و خاکزی Arthrobacter luteus تولید میشود. پس از افزودن آب دو بار تقطیر، بافر، و آنزیم AluI به میزان مناسب برای هر نمونه (جدول 3-7) و تهیه مخلوط واکنش، برای شمار نمونههای مورد نظر، 10 میکرولیتر از فرآورده PCR به آن افزوده شد. واکنشهای هضم در طول شب در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد انجام شدند.
جدول 3-7- ترکیبهای لازم برای هضم آنزیمی در هر واکنش هضم
ترکیب
مقدار
آب دیونیزه
2.1 میکرولیتر
بافر آنزیم
5.1 میکرو لیتر
آنزیم AluI
سه واحد
فرآورده PCR
10 میکرولیتر
تهیه ژل 5/2 درصد آگارز مشابه ژل یک درصد است، با این تفاوت که در این حالت، 5/2 گرم آگارز در 100 میلیلیتر بافر TAE 1x ،حل میشود. بعد از انجام واکنشهای هضم، برای بررسی اندازهی قطعات حاصل از هضم آنزیمی، کل حجم هر نمونه با 2 میکرولیتر بافر بارگذاری، آمیخته و به چاهک ژل 5/2 درصد انتقال داده شد. سپس، ولتاژ دستگاه در 75 ولت تنظیم و به مدت 90 دقیقه فرآیند الکتروفورز انجام شد. پس از پایان زمان الکتروفورز، ژل روی صفحه U.V. Transilluminator بررسی و از آن عکسبرداری شد. به کمک خطکشهای DNA که همراه نمونهها در ژل بارگذاری شده بود، قطعات حاصل از برش، اندازهگیری شد.
3-6- واکاوی همراهی چندریختیها با صفات تولیدی و تولیدمثلی
در این پژوهش همراهی چندریختیهای ژن هورمون رشد و گیرندهی آن با صفات تولید شیر، سختزایی، دوقلوزایی، مردهزایی، فاصلهی زایش، شمار روزهای باز، فاصلهی بین زایش تا اولین فحلی و شمار تلقیح به ازای هر آبستنی بررسی شد. مدل آماری استفاده شده، به صورت زیر بود.