نگهداری و سانتریفیوژ


Widget not in any sidebars

5- به مدت 10 ثانیه و در سرعت g 5000 نمونهها سانتریفیوژ شدند، و سپس مایع بالایی آنها دور ریخته شد.
6-200 میکرولیتر ماده Lysis Reagent به رسوب سفید رنگ ته میکروتیوبها افزوده شد، و با ورتکس محیط یکسانی حاصل شدند.
7- به محیط همگن شده، 400 میکرولیتر Saline Buffer افزوده شد و نمونهها چند بار بالا و پایین شدند.
8- نمونهها به مدت 10 ثانیه در سرعت g 5000 سانتریفیوژ شدند، و سپس مایع بالایی آنها دور ریخته شدند.
9- 500 میکرولیتر Saline Buffer به رسوب سفید رنگ ته میکروتیوبها افزوده شد، و با ورتکس محیط یکسانی حاصل شد.
10- نمونهها به مدت 10 ثانیه در سرعتg 5000 سانتریفیوژ شدند.
11- میکروتیوبها به مدت 10 دقیقه به صورت دربباز در انکوباتور با درجهی حرارت 65 درجه قرار داده شدند.
12- بعد از خارج کردن نمونهها از انکوباتور در صورتی که بوی الکل نداشت، 80 میکرولیتر Extra Gene E به هر نمونه اضافه شد و با ورتکس مخلوطی همگن حاصل شد.
13 – نمونهها، به مدت 10 دقیقه، در انکوباتور با دمای 65 درجه سانتیگراد قرار گرفتند.
14- بعد از خارج کردن نمونهها از انکوباتور، با ورتکس محیط همگن شدند.
15- نمونهها به مدت 2 دقیقه با سرعت g 10000 سانتریفیوژ شدند.
16- بخش بالایی میکروتیوبها که دارای DNA بود، به میکروتیوبهای جدید منتقل شد و در دمای منفی 20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
3-3- بررسی کمیت و کیفیت استخراج
پس از استخراج DNA، کمیت و کیفیت DNAی استخراج شده، با استفاده از دستگاه نانودراپ (Nanodrop) مدل T100 و الکتروفورز روی ژل آگارز یک درصد بررسی شد.
3-3-1 الکتروفورز DNAی استخراج شده روی ژل آگارز یک درصد
مقدار 1 گرم آگارز در 100 میلیلیتر بافر 1X TAE حل و چند دقیقه جوشانده شد. بعد از اضافه کردن اتیدیوم برماید به محلول (رنگ محلول صورتی پوست پیازی شود)، درون سینی ژل که دو طرف آن بسته شده و شانه مخصوص روی آن گذاشته شده بود، ریخته شد.
بعد از سرد شدن ژل، دو طرف سینی را باز کرده و شانه به آرامی خارج شد. ژل به همراه سینی در تانک دارای بافر 1X TAE قرار داده شد. ارتفاع بافر باید به حدی باشد که سطح ژل را تا چند میلیلیتر بپوشاند.
مقدار 4 میکرولیتر از DNA استخراج شده، با یک میکرولیتر بافر بارگذاری آمیخته و به چاهک ژل انتقال داده شد.
ولتاژ دستگاه در 80 ولت تنظیم و برای 90 دقیقه فرآیند الکتروفورز انجام شد.
پس از پایان الکتروفورز، ژل روی صفحهی U.V. Transilluminator بررسی و از آن عکسبرداری شد.
3-3-2- تهیه بافر 50x TAE
مقدار 2/242 گرم تریس باز، 57 میلیلیتر اسید استیک 99 درصد و 100 میلیلیتر EDTA نیم مولار با pH 5/7 تا 8، با هم مخلوط شدند.
حجم محلول با استفاده از آب مقطر به یک لیتر رسید.
3-3-3-تهیه بافرTAE 1X