مواد و روشها و هورمون رشد


Widget not in any sidebars
جابهجایی، حذف یا اضافه شدن نوکلئوتیدها توسط برخی از آنزیمهای محدود کننده قابل شناسایی هستند. با شناسایی محل برش این آنزیمها در مولکولهای DNA، قطعات DNA با طولهای متفاوت ایجاد میشود که به آنها چندریختی در طول قطعات برشی یاRFLP گویند (Botstein et al., 1980). در نوکلئوتید شمارهی 2141 از اگزون شمارهی 5 ژن هورمون رشد، یک جهش شناسایی شده است، که در آن نوکلئوتید دارای باز گوانین جایگزین نوکلئوتید دارای باز سیتوزین شده است، و در پی آن در اسید آمینه شماره 127 هورمون رشد، اسید آمینهی والین جایگزین اسید آمینهی لوسین میشود. این جهش، یک ناحیهی برشی برای آنزیم برشی AluI (گرفته شده از باکتری Arthrobacter luteus) ایجاد میکند (Lucy et al., 1991). جهش دیگر، در نوکلئوتید شمارهی 2291 شناسایی شده است، که در آن نوکلئوتید دارای باز سیتوزین جایگزین نوکلئوتید دارای باز آدنین میشود، اما چون هر دو کدون، اسید آمینهی آرژنین را رمز میکنند، در پروتئین حاصل تغییر ایجاد نمیشود. این جهش با آنزیم برشی DdeI (گرفته شده از باکتری Desulfovibrio desulfuricans) قابل شناسایی است (Yao et al., 1996). یک جهش در نوکلئوتید شمارهی 1547 در اینترون شمارهی 3 شناسایی شده است که ناحیهی برشی برای آنزیم MspI (گرفته شده از باکتریMoraxella sp.) ایجاد میکند. در این جهش نوکلئوتید دارای باز تیمین با نوکلئوتید دارای باز سیتوزین جایگزین شده است (Zhang et al., 1993).
2-1-3- همراهی چندریختیهای ژن هورمون رشد با صفات تولیدی و تولید مثلی
همراهی برخی چندریختیهای ژن هورمون رشد با صفات تولیدی و تولید مثلی در چندین پژوهش بررسی شده است. پژوهشها نشان دادهاند که چندریختی MspI در اینترون 3 با تولید چربی، تولید شیر و رشد بیضهها همراهی معنیدار دارد (Høj et al., 1993; Unanian et al., 2002; Yao et al., 1996). در یک پژوهش همراهی چندریختی HaeIII (گرفته شده از باکتری Haemophilus aegyptius.) با ضخامت چربی پشت در گاو گوشتی معنیدار گزارش شد (Suguisawa et al., 2006). چند ریختی AluI در اگزون 5 ژن هورمون رشد با جایگزین شدن نوکلئوتید دارای باز گوانین با نوکلئوتید دارای سیتوزین در نوکلئوتید شماره 2141 ایجاد شده است، و در پی آن در اسید آمینه 127 هورمون رشد، اسید آمینهی والین جایگزین اسید آمینهی لوسین میشود. بنابراین، این چند ریختی دارای دو الل لوسین (L) و والین (V) است. سورنسن و همکاران (Sørensen et al., 2002) نشان دادند که بین چند ریختی AluI با آزادسازی هورمون رشد همراهی وجود دارد، به گونهای که در گوسالههای با ژنوتیپهای LL و LV آزاد سازی هورمون رشد، بیشتر بود. کیوری و همکاران (Curi et al., 2006) چند ریختی AluI را در نژادهای نلور، کانچیم، آنگوس و سیمنتالبررسی کردند و گزارش کردند که فراوانی الل L در این چهار نژاد به ترتیب 1، 3/93، 2/92 و 7/71 درصد بود؛ و همچنین گاوهای با ژنوتیپ LL وزن لاشه و افزایش وزن روزانهی بیشتری داشتند. گروچوفسکی و همکاران (Grochowska et al., 2001) نشان دادند که بین غلظت هورمون رشد و فاکتور رشد شبه انسولین-1 (IGF-I) با تولید شیر، پروتئین و چربی همراهی وجود دارد. در این پژوهش با بررسی چندریختی AluI مشخص شد که گاوهای دارای الل L نسبت به گاوهای بدون این الل، چربی و پروتئین بیشتری تولید کردند. بالو و همکاران (Balogh et al., 2009) گزارش کردند که چندریختی AluI با تولید شیر، نخستین تخمکگذاری پس از زایش و نمرهی بدنی در ماه اول پس از زایش در گاو هلشتاین همراهی ندارد. برندز و همکاران (Barendse et al., 2006) گزارش کردند که فراوانی آلل L در نژاد آنگوس 77 درصد و در نژاد شورت هورن 76 درصد است. این چندریختی با صفت ماربلینگ گوشت و چربی کپل همراهی معنیدار داشت. همراهی چندریختی AluI در اگزون 5 با تولید شیر در گاوهای هلشتاین نخستین بار توسط لوسی بررسی شد (Lucy, 1993b)، که گزارش کرد گاوهای دارای الل L نسبت به گاوهای دارای الل V شیر بیشتری تولید کردند. شریفلو و همکاران (Shariflou et al., 2000) گزارش کردند گاوهای با ژنوتیپهای LL و LV، شیر، پروتئین و چربی بیشتری تولید کردند، و آلل L نسبت به آلل V غالب بود. خاتمی و همکاران (Khatami et al., 2005) گزارش کردند که چندریختی AluI با تولید شیر و چربی همراهی دارد. در این پژوهش، گاوهای دارای ژنوتیپ LV شیر بیشتری تولید کردند. دیباس و همکاران (Dybus, 2002) نشان دادند که فراوانی آلل L در نژاد هلشتاین 5/81 درصد است، و این چندریختی با تولید شیر در شکم اول همراهی معنیدار دارد؛ به گونهای که تولید شیر، چربی و پروتئین در ژنوتیپ LL بیشترین بود.
2-2- گیرندهی هورمون رشد
هورمون رشد با اثر بر گیرندههای خود در سطح سلول هدف، بر رشد و متابولیسم تاثیر دارد (Lanning and Carter-Su, 2006)، بنابراین، گیرندهی هورمون رشد میانجیگر اثرهای سوماتوژنیک و متابولیک هورمون رشد بر سلول هدف است. گیرندهی هورمون رشد در دستهی یک ابر خانوادهی گیرندههای سایتوکین-هورمون رشد-پرولاکتین قرار دارد. اعضای این خانواده شامل گیرندههای اریتروپویتین، فاکتور محرک کلنی گرانولوسایت، اینترلوکین 2-9-11-12، ترومبوپویتین و فاکتورهای مهار سرطان خون است (Kelly et al., 1991). این نوع گیرنده، دارای بخش خارج سلولی هیدروفوبیک، بخش داخل غشایی و بخش داخل سلولی (سیتوپلاسمی) است (Kelly et al., 1994). در بخش سیتوپلاسمی گیرنده و نزدیک غشای سلولی، یک توالی سرشار از پرولین وجود دارد که به جعبهی یک موسوم است و در همهی گیرندههای این خانواده وجود دارد (Argetsinger and Carter-Su, 1996). آزمایشها نشان دادهاند که وزن مولکولی گیرندهی هورمون رشد 100 تا 130 کیلودالتون است و دارای 620 اسیدآمینه است (Govers et al., 1999). مطالعهی ساختمان کریستالی هورمون رشد نشان داده است که یک مولکول از این هورمون به بخش خارج سلولی گیرندهی خود متصل میشود، و اثر خود بر سلول را اعمال میکند (De Vos et al., 1992; Wells, 1996).
2-2-1- فرآیند انتقال پیام توسط گیرندهی هورمون رشد
مطالعات اولیه در مورد نحوهی پیوند هورمون رشد به بخش خارج سلولی گیرندهی آن نشان داد که هورمون رشد به صورت پیدرپی به دو گیرنده متصل میشود و دایمر تشکیل میدهد. در گذشته، به نظر میرسید که ایجاد ترکیب هورمون-گیرنده برای آغاز انتقال پیام ضروری است (Wells, 1996). با این حال مطالعات جدیدتر نشان دادهاند که گیرندهی هورمون رشد پیش از پیوند هورمون به آن، به صورت دایمر است (Gent et al., 2002; Brown et al., 2005). هورمون رشد دارای دو جایگاه اتصال جداگانه و نامتقارن در دو سمت ساختار خود است، که پیوند این دو نقطه با نقاط اتصال در گیرنده، منجر به یک چرخش در گیرنده میشود (Brown et al., 2005). با چرخش دایمر گیرنده آنزیمهای غیرفعال تایروزین کیناز از خانواده جانوس کیناز 2، که در زیر غشا در بخش سیتوپلاسمی دو گیرنده قرار دارند، فسفریله میشوند (Argetsinger et al., 1993; Argetsinger et al., 2004). جانوس کیناز 2 فعال شده، نقاط فعالی برای جذب فاکتورهای رونویسی مانند STAT5 ایجاد میکند (Herrington et al., 2000). STAT5 فسفریله شده، به عنوان فاکتور رونویسی در بیان ژنهایی که توسط هورمون رشد تنظیم میشوند، عمل میکنند، این فاکتورها در بیان ژن هایی که در فرآیندهای حیاتی مثل تغییرات متابولیکی و رشد دخالت دارند، موثر هستند (Herrington et al., 2000).
2-2-2- ژن گیرندهی هورمون رشد
گیرندهی هورمون رشد در گاو توسط یک ژن روی کروموزوم 20 رمز میشود (Moody et al., 1995). این ژن دارای 9 اگزون در بخش ترجمه شونده و یک بخش ‘5 است که ترجمه نمیشود (5’UTR) است. بخش ‘5 ترجمه ناپذیر نیز 5 اگزون دارد (1A-1I) که به گونهای پیدرپی بهم چسبیده و شروع رونویسی هر کدام بصورت اختصاصی است (Heap et al., 1995; Lucy et al., 1998)
2-2-3 چندریختیهای ژن گیرندهی هورمون رشد
در راهانداز ژن گیرندهی هورمون رشد در فاصله 154-، نوکلئوتید دارای باز آدنین جایگزین نوکلئوتید دارای باز گوانین میشود، که با آنزیم برشی NsiI (گرفته شده از باکتری Neisseria sicca) قابل شناسایی است (Ge et al., 1999). سه جهش در بخش ‘5 ترجمهناپذیر(5’UTR) شناسایی شده است. بدین صورت که، جایگزین شدن نوکلئوتیدی دارای باز آدنین با نوکلئوتیدی دارای باز تیمین برای آنزیم AluI و جایگزین شدن نوکلئوتیدی دارای باز سیتوزین با نوکلئوتیدی دارای باز تیمین برای آنزیمهای AccI (گرفته شده از باکتری Acinetobacter calcoaceticus) و StuI (گرفته شده از باکتری Streptomyces tubercidicus) ناحیهی برشی ایجاد میکند. (Aggrey et al., 1999). چندریختی دیگری نیز در بخش ‘5 ترجمه ناپذیر، گزارش شده است که در آن جابجایی نوکلئوتید دارای باز سیتوزین با نوکلئوتید دارای باز تیمین در دو نقطه بالای راهانداز یک و داخل راه انداز یک ایجاد شده است و به ترتیب با آنزیمهای محدودکنندهی Fnu4HI/Tsel (گرفته شده از باکتری Fusobacterium nucleatum 4H) و Sau961 (گرفته شده از باکتری Staphylococcus aureus PS96) قابل شناسایی هستند (Maj and Zwierzchowski, 2006). در اگزون 10، در فاصلهی 257 جفت باز از نقطهی ‘5، جایگزینی نوکلئوتید دارای باز آدنین با نوکلئوتید دارای باز گوانین برای آنزیم AluI ناحیهی برشی ایجاد کرده است. همچنین گزارش شده است که در فاصلهی 200 جفت باز از نقطهی ‘5 در این اگزون، جایگزینی نوکلئوتید دارای باز آدنین با نوکلئوتید دارای باز گوانین برای آنزیم NarI (گرفته شده از باکتری Nocardia argentinensis) و جایگزینی باز تیمین با باز سیتوزین برای آنزیم MaeI (گرفته شده از باکتری Methanococcus aeolicus PL-15/H) قابل شناسایی است (Ge et al., 2000). جایگزینی در فاصلهی 257 جفت باز از نقطهی ‘5 باعث جایگزین شدن اسید آمینه سرین با گلایسن (S555G) در اسید آمینهی شمارهی 555 بخش داخل سیتوپلاسمی گیرندهی هورمون رشد میشود. در اگزون 8، نوکلئوتید دارای باز تیمین با نوکلئوتید دارای باز آدنین جایگزین میشود، و به دنبال آن در بخش داخل غشایی اسید آمینهی فنیلآلانین که بار آن خنثی است، جایگزین تایروزین قطبی میشود (F279Y) و ناحیهی برشی برای آنزیم VspI (گرفته شده از باکتری Vibrio sp. 343)(Blott et al., 2003) و آنزیم SspI (گرفته شده از باکتری Sphaerotilus sp.) ایجاد میکند (Fontanesi et al., 2007)
2-2-4- همراهی چندریختیهای گیرندهی هورمون رشد و صفات تولیدی و تولیدمثلی
فلکی و همکاران (Falaki et al., 1996) با بررسی چندریختی TaqI در اگزونهای 9 و 10 در گاوهای هلشتاین، نشان دادند که این چندریختی با تولید چربی همراهی دارد. اگری و همکاران (Aggrey et al., 1999) با بررسی چندریختیهای AccI، StuI و AluI در بخش 5′ UTR در گاوهای هلشتاین گزارش کردند که چندریختی AluI با ارزش اصلاحی چربی شیر همراهی معنیدار دارد. مج و همکاران (Maj et al., 2004) گزارش کردند که چندریختیهای NsiI و AccIدر بخش غیر رمزکنندهی گیرندهی هورمون رشد با صفات تولید شیر و ترکیبات شیر همراهی معنیدار دارد. کومیسرک و همکاران (Komisarek et al., 2011) گزارش کردند که همراهی چندریختی VspI در اگزون 8 با درصد چربی، شیر و پروتئین شیر معنی دار است.
چند ریختی AluI با جایگزینی باز گوانین با آدنین ایجاد میشود و درپی آن در گیرندهی هورمون رشد، اسید آمینهی سرین جایگزین گلایسین میشود. این تغییر دو آلل A و G ایجاد میکند. دایاس تاسیو و همکاران (Di Stasio et al., 2005) گزراش کردند که چند ریختی AluI در اگزون 10 با صفت افت وزن در گوشت گوسالههای نژاد پایمانتیز رابطه معنی دار دارد. اولنسکی و همکاران (Oleński et al., 2010) گزارش کردند که چندریختی AluI در اگزون 10 با صفات تولید شیر و ترکیبات آن در گاوهای شیری و ارزش اصلاحی گاوهای نر همراهی معنی دار دارد. آلل A برچربی و پروتئین و آلل G بر مقدار تولید شیر موثر بود. کواکس و همکاران (Kovacs et al., 2006) گزارش کردند که چندریختی AluI در اگزون 10 با تولید شیر و فاصلهی زایش در گاوهای هلشتاین همراهی معنی دار ندارد. هاردکا و همکاران (Hradecká et al., 2008) با بررسی چند شکلی AluI در اگزون 10 گزارش کردند که فراوانی آلل A در نژاد هلشتاین1/95 درصد است. بین این چندریختی و ارزش اصلاحی چربی شیر همراهی معنیدار وجود دارد و گاوهای دارای ژنوتیپ GG ارزش اصلاحی کمتری برای چربی شیر نسبت به گاوهایی با ژنوتیپ AA بودند.
فصل سوم
مواد و روشها
3-1- محل اجرای پژوهش
این پژوهش با همکاری دو واحد پرورش گاو شیری هلشتاین در استان فارس انجام شد. در این پژوهش، از 130 گاو شیری که دستکم برای یک دورهی شیردهی رکورد تولیدی و تولید مثلی داشتند، با استفاده از ونوجکتهای دارایEDTA خونگیری شد. نمونهها درون یخ قرار داده شدند و در آزمایشگاه مرکزی دانشکده دامپزشکی دانشگاه شیراز، در دمای منفی 20 درجهی سانتیگراد نگهداری شدند. همهی فرآیندهای آزمایشگاهی در آزمایشگاه مرکزی دانشکدهی دامپزشکی انجام شد.
3-2- استخراج DNA
استخراج DNA ژنومیک با استفاده از کیت استخراج DNA شرکت ژن فناوران در چند گامه انجام شد:
1-100 میکرولیتر از نمونهی خون در داخل میکروتیوبهای 5/1 میلیلیتری ریخته شد.
2-400 میکرولیتر مادهی Lysis Reagent به هر نمونه افزوده شد، نمونهها به هم زده شدند تا در ته میکروتیوبها رسوب دیده شود.
3- نمونهها به مدت 5 دقیقه در داخل انکوباتور با حرارت 65 درجه سانتیگراد قرار داده شد.
4- نمونهها از انکوباتور خارج شدند، و 20 میکرولیتر ماده جذب کنندهی Nuclease به هرنمونه افزوده شد، و به مدت 10 دقیقه بههم زده شدند.